SN∕T 5178-2021 按蚊属分子鉴定方法
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0.52 |
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14 |
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日期： |
2021-10-25 |
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准,SN/T 5178—2021,按蚊属分子鉴定方法,Molecular identification for genus Anopheles,ICS 11.020,CCS C 62,2021-06-18 发布2022-01-01 实施,中华人民共和国海关总署发 布,I,SN/T 5178— 2021,前 言,本文件按照GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规,定起草,本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口,本文件起草单位：中华人民共和国南京海关、中华人民共和国福州海关、中华人民共和国北京,海关、中国检验检疫科学研究院,本文件主要起草人：杨庆贵、何江、朱军、吴瑜凡、孙立新、张建庆、郭惠琳、黄恩炯、胡双双、,聂国嫒、袁大炜、郭天宇、陆永昌,1,SN/T 5178— 2021,按蚊属分子鉴定方法,1 范围,本文件规定了按蚊（Anopheles Meigen,1818）成虫（包括肢体残缺不全的成虫）及蛹、幼虫、卵的,本文件适用于按蚊属分子的鉴定,2 规范性引用文件,下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文,件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适,用于本文件,GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法,GB 19489 实验室 生物安全通用要求,SN/T 1876 医学媒介生物标本采集、制作及保存规程,SN/T 2752.4 卫生检疫人员的自我防护规范 第4 部分：实验室人员,SN/T 4278 国境口岸医学媒介昆虫DNA 条形码鉴定操作规程,SN/T 4629 检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范,WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用,3 术语和定义,SN/T 4629 和SN/T 4278 界定的术语和定义适用于本文件,4 原理,利用BOLD 中规定的通用引物对线粒体DNA 中的COI 基因的特定片段进行扩增，PCR 产物克隆,或者直接测序后，得到长度不少于500 bp 的有效序列，跟BOLD 系统中的数据进行比对，从而达到,物种快速准确鉴定的目的,5 引物,LCO1490 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,HCO2198 5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’,6 鉴定程序,6.1 准备,实验室需具备的设备和试剂见附录A，实验室生物安全应符合GB 19489（所有部分）中的规定,人员防护应符合SN/T 2752.4（所有部分）中的的规定；PCR 防污染措施应按照WS/T 230 确定的执行,2,SN/T 5178— 2021,6.2 标本的处理,6.2.1 取样,对所检测的标本进行唯一性标示。新鲜标本（包括卵、幼虫、蛹及成虫）及时冷冻或者毒瓶处死,后，投入大于90 %（体积分数）的酒精固定；截获的干燥标本和死标本直接投入大于90 %（体积分数）,的乙醇溶液固定。取样时，尽量减小组织块的体积，尽可能完整地保持凭证标本的形态特征，尤其是,具有重要分类意义的形态特征,6.2.2 凭证标本的制作,将采集或截获的按蚊制成标本，再将取样后的标本作为凭证标本，标本的制作和保存参照SN/T,1876 执行,6.3 基因组DNA 的抽提,6.3.1 样本的处理,取成蚊的1 只腿、1 只蛹或1 头幼虫或者1 只卵，置于无DNA 的洁净1.5 mL 离心管中研磨至粉,末状或者糜状，根据实验室实际情况，选择试剂盒法或者酚/ 三氯甲烷法抽提DNA。提取时应设置空,白对照,6.3.2 DNA 提取方法,6.3.2.1 试剂盒法,按动物组织基因组DNA 提取试剂盒的操作指导书进行基因组DNA 的抽提,6.3.2.2 饱和酚/ 三氯甲烷法,细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的饱和酚溶液，14000 g 离心5 min，转移上清,液至一新的离心管；加入等体积的饱和酚溶液、三氯甲烷、异戊醇(25:24:1)，14000 g 离心5 min，转,移上清液至一新的离心管；加入等体积的饱和酚，14000 g 离心5 min，转移上清液至一新的离心管；,加入2 倍体积的无水乙醇，14000 g 离心5 min，弃上清；加入500 μL 的70 % 乙醇，14000 g 离心1,min，弃上清，重复该步骤一次；室温或者37 ℃彻底干燥离心管，加入50 μL 经高压灭菌的ddH2O 溶,解DNA ；提取的DNA 保存在4 ℃备用，长期保存应-20 ℃以下冷冻保存,6.4 PCR 扩增,6.4.1 PCR 扩增体系,根据实际情况，可以选择50 μL 体系，或者25 μL 体系。为了验证PCR 体系有无污染，应同时设,置空白对照和阴性对照。为了验证PCR 反应是否正常，需要设置阳性对照,50 μL 体系见表1,表1 扩增体系,组分名称体积/μL,缓冲液（10×） 5,dNTP（2.5 mmol/L/each） 2,3,SN/T 5178— 2021,组分名称体积/μL,正向引物（20 μmol/L） 1,反向引物（20 μmol/L） 1,Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 0.5,模板(50 ng/μL～100 ng/μL) 3,ddH2O 37.5,25 μL 体系各组分用量是50 μL 体系的一半,6.4.2 PCR 扩增条件,94 ℃预变性3 min ；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，运行29 个循环；……
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